FastDNA土壤樣品提取試劑盒--上海金畔

一、金畔生物介紹

上海金畔生物科技有限公司提供生命科學(xué)研究領(lǐng)域系列產(chǎn)品，包括色譜標(biāo)準(zhǔn)品、生化試劑、診斷試劑、實(shí)驗(yàn)耗材和儀器。標(biāo)準(zhǔn)品和試劑包括分子質(zhì)量測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)品、固體標(biāo)準(zhǔn)品、液體標(biāo)準(zhǔn)品、修飾性PEG等。免疫診斷試劑包括酶、單克隆抗體、多克隆抗體和ELisa試劑盒等多種產(chǎn)品。耗材和儀器包括培養(yǎng)基、移液器、動(dòng)物飼料、離心機(jī)等實(shí)驗(yàn)室常用儀器耗材。因此我們擁有廣泛的客戶群，覆蓋藥物分析、食品安全、聚合物分析、環(huán)境監(jiān)測(cè)、物化工程和生物制藥等領(lǐng)域，主要客戶廣泛分布于食品、制藥、政府機(jī)構(gòu)、第三方檢測(cè)、環(huán)境測(cè)試機(jī)構(gòu)、化工、科研、生物工程等行業(yè)。

二、產(chǎn)品介紹

產(chǎn)品介紹

FastDNA?土壤樣品提取試劑盒，可在30分鐘之內(nèi)，快速、有效地從土壤以及其他環(huán)境樣品中提取基因組DNA。

FastDNA? Spin Kit for Soil（土壤基因組DNA提取試劑盒）用于從土壤中的所有生物包括細(xì)菌、酵母菌、真菌、藻類、線蟲(chóng)類甚至真細(xì)菌的孢子、芽孢中提取基因組DNA。而且它還可以提取其他環(huán)境樣品的DNA，如沉積物、排泄物、廢水、雪水等。只需500mg的樣品即可得到足夠的DNA。

適用研究范圍

土壤樣品，糞便樣品，環(huán)境水樣，廢水樣品，淤泥樣品，沉積物，排泄物，廢水及雪水等環(huán)境樣品

試劑盒組成

貨號(hào)            品名                                       規(guī)格

6914-050   Lysing Matrix E                                   50×2ml

6540-403   PPS（Protein Precipitation Solution）             25ml

6560-203   PPS FOR SOIL KIT                                  25ml

6540-408   Binding Matrix(DNA Binding Matrix Solution)       66ml

6540-405   SEWS-M(Salt/Ethanol Wash Solution)                12ml

6540-406   DES(DNA Elution Solution-Ultra Pure Water)        20ml

6560-205   Sodium Phosphate Buffer                           60ml

6540-407   BBS gel loading dye                               200ul

6511-202   MT Buffer                                         8ml

6560-210   SPIN Filters                                      50

6560-211   Catch Tubes                                       50

實(shí)驗(yàn)者需自備的儀器及耗材

FastPrep? Instrument                                （fastprep 儀器）

Microcentrifuge that can freely spin 2.0 ml tubes       （可裝載2.0ml管子的離心機(jī)）

Microcentrifuge tubes (2.0 ml and 1.5 ml)              （可裝載1.5和2.0ml管子的離心機(jī)）

Clean 15 ml tubes for DNA binding                  （干凈的15ml管 用于DNA結(jié)合）

Rotator or low-speed vortex                           (振蕩器)

實(shí)驗(yàn)操作步驟說(shuō)明（有Fastprep儀器情況下）

試劑準(zhǔn)備：

1. 使用前先在SEWS-M Wash Solution中加入100 ml 100%的乙醇，混勻。在瓶子上做好標(biāo)記，密閉儲(chǔ)存于室溫條件。

提取步驟：

1. 在樣品處理管E中加入至多500 mg的土壤樣品

2. 將978 μl的Sodium Phosphate Buffer加入到樣品處理管E中

3. 再加入122 μl的 MT Buffer

（為了得到良好的樣品處理效果，請(qǐng)?jiān)诩尤胪寥罉悠芳皟蓚�(gè)緩沖液后，在樣品處理管中仍能保留有250 – 500μl 空間）

4. 將樣品置于FastPrep? 儀器上，樣品處理?xiàng)l件一般為，時(shí)間：40秒，速度：6.0

（如果樣品需要額外的處理時(shí)間，請(qǐng)?jiān)陂g隔期將樣品處理管在冰上孵育至少2分鐘，以免樣品過(guò)熱）

5. 14,000 x g離心5~10分鐘

（如果把離心時(shí)間延長(zhǎng)到15分鐘，可以更好地使樣品量較大的；或者細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)較復(fù)雜的細(xì)胞的碎片沉降到管底）

6. 將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的2.0 ml離心管中。加入250μL的PPS溶液（蛋白質(zhì)沉淀溶液），用手搖晃10次，使之充分的混合。

7. 14,000 x g離心5分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的15ml管中

(此處也可使用2Ml管，但使用大管子能獲得更好的混合和DNA綁定效果)

8. 重懸硅珠（Binding Matrix）溶液，將1.0 ml重懸液加入該15ml管中。

9. 使用振蕩器或者手動(dòng)震蕩2分鐘，將DNA綁定在硅珠上。將管子置于管架上，靜置3分鐘，使硅珠沉淀下來(lái)。

10. 小心地移除500μl的上清液，避免吸取到沉淀下來(lái)的硅珠。

11. 將硅珠在剩余的上清液中重懸。轉(zhuǎn)移約600μl的重懸液至SPIN? Filter中，14,000 x g離心1分鐘。棄去接液管中的廢液，將15ml管中剩余的重懸液轉(zhuǎn)移到SPIN? Filter再次離心棄去廢液。

12. 加入500 μl事先準(zhǔn)備好的SEWS-M溶液，用槍頭輕輕吹打，小心地重懸沉淀。

13. 14,000 x g離心1分鐘，棄去廢液。

14. 不加其他溶液，將SPIN? Filter 14,000 x g離心2分鐘，除去殘留的SEWS-M溶液。棄去接液管，更換一個(gè)新的、干凈的離心管。

15. 將SPIN? Filter置于室溫下晾干5分鐘

16.輕輕地用50-100 μl 的DES溶液（或者無(wú)菌/無(wú)DNA酶的水）重懸SPIN filter上的硅珠

（為了避免過(guò)度稀釋純化出的DNA，請(qǐng)盡量減少DES溶液的量，55?C孵育5分鐘能幫助提高純化產(chǎn)物的得率）

17. 14,000 x g離心1分鐘使溶解的DNA轉(zhuǎn)移到接液管中。棄去SPIN? Filter

（得到的純化產(chǎn)物可直接用于PCR等其他下游的操作，4°C使用前保存或者-20°C長(zhǎng)期保存。）

技術(shù)優(yōu)勢(shì)

1. 能有效的處理土壤樣品中一些很難處理的組分如： 真細(xì)菌孢子（eubacterial spores）、內(nèi)芽孢（endospores）、格蘭仕陽(yáng)性菌（gram positive bacteria）、酵母（yeast）、線蟲(chóng)（nematodes）、海藻（algea）、真菌（fungi）等。

2. 樣品處理過(guò)程中使用的 MT Buffer和Sodium Phosphate Buffer可在整個(gè)提取過(guò)程中有效的保護(hù)核酸，并最大限度的降低RNA污染。

3. 基于硅珠的純化方法，可有效地去除腐植酸、多元酚等PCR抑制物

4. 純化所得的DNA可直接用于PCR、酶切都后續(xù)實(shí)驗(yàn)之中。

5. 對(duì)腐植酸含量特別高的樣品，附加額外的處理方法。

注：對(duì)于去除腐植酸的方法

在使用以下任何一種方法之前，請(qǐng)預(yù)先準(zhǔn)備5.5M的異硫氰酸胍（Guanidine Thiocyanate）溶液

方法A：

1.當(dāng)操作到土壤DNA提取試劑盒的第九步時(shí)，使用14,000 x g (~約5秒)的短時(shí)離心替代硅珠的自然沉降，移除上清。

2.用1ml事先準(zhǔn)備好的異硫氰酸胍溶液洗滌、重懸硅珠。

3.14,000 x g (~約5秒)短時(shí)離心該離心管，除去上清。

4.重復(fù)上述的洗滌步驟，直到硅珠恢復(fù)到原先的顏色。

5.最后一次洗滌之后，用1ml的異硫氰酸胍溶液重懸硅珠，將600μl重懸液轉(zhuǎn)移到SPIN filter里，14,000 x g離心1分鐘。

6.移除接液管中的廢液，將剩余的重懸液轉(zhuǎn)移至SPIN filter里，14,000 x g離心1分鐘，棄去廢液。

7.從提取試劑盒操作說(shuō)明的第十二步開(kāi)始繼續(xù)操作。

方法B：

1.將下列成分混合于1.5ml的離心管中，組成腐植酸洗滌液：

978 μl Sodium Phosphate Buffer

122 μl MT Buffer

250 μl PPS

2.充分混勻后，全速離心1分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中（容量大于或等于2ml）

3.加入等體積的5.5M的異硫氰酸胍溶液、混勻。

4.完成了土壤試劑盒操作說(shuō)明中的第九步后，將500μl的腐植酸洗滌液加入SPIN filter

5.14,000 x g離心1分鐘，棄去廢液。

6.重復(fù)上述的洗滌步驟，直到硅珠恢復(fù)到原先的顏色。

7.從提取試劑盒操作說(shuō)明的第十二步開(kāi)始繼續(xù)操作。

實(shí)驗(yàn)操作步驟說(shuō)明（沒(méi)有Fastprep儀器情況下）

1.稱取0.3 g~0.4 g樣品加入Lysing Matrix E Tube 中。（注意：需保證加完樣品及所需溶液后，管中應(yīng)留出不少于200 μL空間）

2.加入978 μL SPB，加入122 μL MT Buffer。

3.蓋緊Lysing Matrix E Tube的蓋子，將離心管置于渦旋混合儀上，對(duì)管內(nèi)物質(zhì)進(jìn)行震蕩破碎均質(zhì)化，時(shí)間設(shè)定為40 s~50 s。（注意：時(shí)間不可過(guò)長(zhǎng)，有可能打斷基因組DNA片段降低提取質(zhì)量）從各個(gè)角度都可以震蕩一下，不要光是底部。

4.在8000 r/min轉(zhuǎn)速下離心15 min，有利于去除體積較大或具有復(fù)雜細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的樣品碎屑。

5.將上清液用大口槍頭吸出轉(zhuǎn)入1.5 mL的微離心管中，加入250 μL PPS，手持離心管晃動(dòng)10次以混勻。

6.在8000 r/min下離心5 min，用大口槍頭將上清液轉(zhuǎn)移至5 mL離心管中。

7.搖勻Binding Matrix后，吸取1.0 mL加入上一步離心管中。

8.將離心管上下顛倒2 min后，靜置3 min，使DNA附著于Bingding Matrix上，并等待二氧化硅基質(zhì)沉淀。（這一步根據(jù)沉淀情況時(shí)間可以適當(dāng)延長(zhǎng)）

9.小心移除600 μL上清液，避免吸出沉淀物。

10.將剩余的上清液與沉淀物重新混勻，吸取約600 μL混合液移入SPIN Filter中，8000 r/min

下離心1 min。

11.倒掉收集管中的液體，111重復(fù)上一步操作直至5 mL離心管中的液體吸盡。

12.加入已制備好的SEWS-M溶液500 μL，用小槍頭小心混勻后，8000 r/min下離心1 min

后，棄去收集管中的液體。

13.為更好的去除雜離子，重復(fù)第12步，更換為1.5 mL離心管。

14.在8000 r/min下離心2 min，去除殘留的SEWS-M溶液，然后更換為干凈的1.5 mL離心管。（若發(fā)現(xiàn)殘余溶液較多，可重復(fù)此步驟）

15.在室溫下，將SPIN Filter風(fēng)干5 min。（時(shí)間可以更久一些）

16.往SPIN Filter加入80 μL DES溶液，用小槍頭小心使之與Binding Matrix混勻，65℃水浴15 min（有利于DNA的溶出）。8000 r/min下離心2 min，可得到約50 μL的DNA溶液。再加入80 μL DES溶液重復(fù)第16步操作，一共可得到約100 μL的DNA溶液。

17.棄去SPIN Filter，將提取好的DNA存于-20℃冰箱保存。

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參看文獻(xiàn)

Soil -

Jacob B?lum et al. (2006). Appl. Envir. Microbiol., Vol 72: 1476 - 1486.

Sediment -

Tracy J. Mincer et al. (2005). Appl. Envir. Microbiol., Vol 71: 7019 - 7028.

Snow samples -

Takahiro Segawa et al. (2005). Appl. Envir. Microbiol., Vol 71: 123 - 130.

Feces -

Alice Layton et al. (2006). Appl. Envir. Microbiol., Vol 72: 4214 – 4224

Sediments and Soil -

Francis C.A. et al. (2005). PNAS. Vol 102: 14683 – 14688

Soil -

Akira Ando et al. (2005). Appl. Envir. Microbiol., Vol. 71: 7075-7082

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